手性色譜柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光學活性的單體，固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。

界說：

通過引入手性環(huán)境使對映異構(gòu)體間出現(xiàn)物理特征的差異，然后抵達光學異構(gòu)體拆分的目的。要完成手性辨認，手性化合物分子與手性固定相之間至少存在三種互相效果。這種互相效果包括氫鍵、偶極-偶極效果、π-π效果、靜電效果、疏水效果或空間效果。手性分別效果是多種互相效果一同效果的效果。這些互相效果通過影響包埋復合物的構(gòu)成，特別位點與分析物的鍵合等而改動手性分別效果。由于這種效果力較微弱，因此需求細心調(diào)理、優(yōu)化活動相和溫度以抵達*佳分別效果。

分類及運用：

迄今為止，尚沒有一種相似十八烷基鍵合硅膠（ODS）柱的廣泛適用的手性柱。不同化學性質(zhì)的異構(gòu)體不得不選用不同類型的手性柱，而市售的手性色譜柱一般價格昂貴，因此怎么根據(jù)化合物的分子結(jié)構(gòu)選擇適用的手性色譜柱對錯常重要的。

分類體系：

根據(jù)手性固定相和溶劑的互相效果機制，Irving Wainer初度提出了手性色譜柱的分類體系：

第1類：通過氫鍵、π-π效果、偶極-偶極效果構(gòu)成復合物。

第2類：既有類型1中的互相效果，又存在包埋復合物。此類手性色譜柱中典型的是由纖維素及其衍生物制成的手性色譜柱。

第3類：根據(jù)溶劑進入手性空穴構(gòu)成包埋復合物。這類手性色譜柱中*典型的是由Armstrong教授開發(fā)的環(huán)糊精型手性柱[2]，其他冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）構(gòu)成的手性色譜柱也歸于此類。

第4類：根據(jù)構(gòu)成非對映體的金屬絡合物，是由Davankov開發(fā)的手性分別技術，也稱為手性配位溝通色譜（CLEC）。

第5類：蛋白質(zhì)型手性色譜柱。手性分別是根據(jù)疏水互相效果和極性互相效果完成。

可是，隨著由于市場上可選擇的手性色譜柱越來越多，此分類體系有時很難將一些手性柱概括進去。因此參看Irving Wainer的分類方法，根據(jù)固定相的化學結(jié)構(gòu)，將手性色譜柱分為以下幾種：

刷（Brush）型或稱為Prikle型

纖維素（Cellulose）型

環(huán)糊精（Cyclodextrin）型

大環(huán)抗生素（Macrocyclicantibiotics）型

蛋白質(zhì)（Protein）型

配位溝通（|Ligandexchange）型

冠醚（Crown ethers）型

1、刷型：

刷型手性色譜柱的出現(xiàn)和展開源于Bill Prikle及其搭檔的卓越作業(yè)。六十年代，Bill Prikle將手性核磁共振中的效果運用到手性HPLC固定相研討中，通過不斷實踐，發(fā)清楚運用規(guī)劃較廣、柱效很好的手性色譜柱。刷型手性色譜柱是根據(jù)三點辨認方式規(guī)劃的，歸于Irving Wainer分類中的*種類型。

刷型手性固定相分為π電子接受型和π電子供應型兩類。*常見的π電子接受型固定相是由（R）-N-3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸鍵合到γ-氨丙基硅膠上的制成。此類刷型手性色譜柱可以分別許多可供應π電子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等對化合物進行衍生化后進行手性分別。

π電子供應型固定相常見的是共價結(jié)合到硅膠上的萘基氨基酸衍生物，這種固定相要求被分析物具有π電子接受基團，例如二硝基苯甲�；�。醇類、羧酸類、胺類等，可以用氯化二硝基苯甲酰、異腈酸鹽、或二硝基苯胺等進行衍生化后，用π電子供應型固定相抵達手性分別。

刷型固定相的優(yōu)勢在于其易于組成。組成方法在Bill Prikle的著作中有詳細的闡明。其他，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的選擇因子。它的晦氣之處在于它僅對芳香族化合物有用，有時不得不進行衍生化反響。但值得一提的是，這種衍生化反響對錯手性衍生反響，所以不存在手性衍生的問題。刷型手性色譜運用的活動相基本是極性弱的有機溶劑，這關于制備色譜來講未必是缺點。

近來，刷型固定相出現(xiàn)了π電子供應和接受基因的混合固定相。如：WHELK-O和BLAMO，及α-BURKE-Ⅱ固定相。α-BURKE-Ⅱ相十分適用于β-阻斷劑的手性分別。典型的活動相為二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物，比例為85：10：5。參加10mM醋酸銨可以調(diào)整保存時刻。SS BLAMO Ⅱ，一同具有π電子供體區(qū)和受體區(qū)，構(gòu)成手性裂縫，因此關于某些分子具有很高選擇性。

2、纖維素型：

纖維素型手性色譜柱的分別效果包括互相招引的效果及構(gòu)成包埋復合物。它們歸于Wainer分類中的第2種類型。市售的手性色譜柱為微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸鹽纖維素固定相。許多化合物可通過此類型的色譜柱得到分別。這種類型的手性色譜柱種類也很齊全。活動相運用低極性溶劑，典型的活動相為異丙醇-正己烷混合物。這類柱子根據(jù)制作工藝，分為涂敷與鍵合兩大類。但特別要注意由于氯可以使涂敷纖維素從硅膠上墜落，因此要保證涂敷類柱子活動相中無含氯溶劑。

3、環(huán)糊精型：

環(huán)糊精是通過BacillusMacerans 淀粉酶或環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶水解淀粉得到的環(huán)型低聚糖。通過操控環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶的水解反響條件可得到不同尺度的環(huán)糊精。市售的環(huán)糊精首要是α、β、γ三種類型，分別含6、7、8個吡喃葡萄糖單元。環(huán)糊精分子成錐筒型，構(gòu)成一個窟窿，窟窿的孔徑由構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的數(shù)目抉擇。環(huán)糊精類型及窟窿的孔徑等見下表：

環(huán)糊精 糖元數(shù)目 窟窿孔徑 可進入窟窿的分子類型，手性中心數(shù)目

α 6 4.5-6.0 5-6元環(huán)的芳香族化合物，30

β 7 6.0-8.0 聯(lián)苯或萘， 35

γ 8 8.0-10.0 代替芘和類固醇， 40

2，3位仲羥基分布在環(huán)糊精洞口，6位伯羥基在環(huán)糊精分子的外部，這意味著窟窿內(nèi)部是相對疏水的區(qū)域。用環(huán)糊精手性固定相產(chǎn)生手性辨認要求被拆分物的疏水部分能嵌入環(huán)糊精窟窿中，構(gòu)成可逆的、安穩(wěn)性不同的包合物，環(huán)糊精洞口的羥基和被拆分物的極性基團互相效果。

由于構(gòu)成包合物速度較慢，因此或許導致色譜峰峰形較差，相同也影響了其在制備色譜中的運用。環(huán)糊精固定相的選擇性取決分析物的分子巨細；α-環(huán)糊精只能容許單苯基或萘基進入，β-環(huán)糊精容許萘基及多代替的苯基進入，γ-環(huán)糊精僅用于大分子萜類。β-環(huán)糊精手性固定相運用規(guī)劃*廣。Ibuprofen通過β-環(huán)糊精色譜柱得到分別，闡清楚pH值對氫鍵的影響。當活動相的pH=7時，觀察不到拆分的痕跡。pH=4時，可抵達好的分別效果。一般分別氨基酸時，常選用低的pH值，以按捺酸性基團的離子化，一同也增強氨基的質(zhì)子化。磷酸三乙胺鹽、乙酸三乙胺鹽證明對β-環(huán)糊精色譜柱來說是很好的緩沖液。一般緩沖液是0.1%三乙胺溶液，用磷酸或醋酸調(diào)理到適宜的pH值。高的流速會下降構(gòu)成復合物的才能，低流速分別效果較好，0.5-1ml/min的流速*好。其他，增加緩沖液的濃度可以克服流速的影響，由于它可以增加環(huán)糊精窟窿和活動相的招引力。

常用緩沖液及其運用濃度如下表所示：

緩沖液 濃度 目的

TEAA（乙酸三乙胺鹽） 0.01-2%

NH4NO3 10-500mM (用于減小包埋)

檸檬酸鹽 10-200mM (特別適合于酸性化合物)

醋酸銨 10-200mM

pH值選擇見下表:

緩沖液 pH值 目的

醇和胺 pH4 (加強NH的離子化)

酸 pH7

優(yōu)化手性分別條件要考慮的方面有：pH值對分別度的影響；流速對分別度的影響；柱溫、有機相比例、緩沖鹽濃度對分別度的影響。

環(huán)糊精的修飾：*近，對環(huán)糊精的修飾使環(huán)糊精型手性色譜柱可以分別更多的化合物，并可用于氣相手性色譜分別。衍生化是通過將不同的基因鍵合到環(huán)糊精窟窿表面的羥基上。衍生化反響包括乙基化、S-羥基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸鹽、3，5二甲基苯基氨基甲酸鹽和環(huán)狀對甲苯酰酯。這些新式的環(huán)糊精固定相有許多長處，它們可以分別更多化合物，價格上也有競爭力，由于改進了手性辨認才能使其更適用于制備色譜。

4、配位溝通型：

手性配位溝通色譜（Chiral LigandExchange Chromatography，CLEC）由

Davankov發(fā)明，是通過構(gòu)成光學活性的金屬絡合物而抵達手性分別，歸于Irving Wainer分類中的第4類手性固定相，首要用于分別氨基酸類。

由于此類固定相是由手性氨基酸—銅離子絡合物鍵合到硅膠或聚合物上形

成，因此活動相中有必要含有銅離子以保證手性固定相上的銅離子不至流失。其它的過渡金屬元素也已用于手性配位溝通色譜，但銅離子運用*廣。構(gòu)成絡合物的過程十分緩慢，因此有時需提高柱溫，*佳溫度約50℃。

手性配位溝通色譜僅對α- 氨基酸和其相似物有用。β- 氨基酸很難用手性

配位溝通色譜得以分別。手性配位溝通色譜可用于制備，由于活動相中存在銅離子，盡管銅離子能用離子溝通柱除掉，但增加了樣品處理的困難。

5、大環(huán)抗生素型：

大環(huán)抗生素型手性色譜柱是*近展開起來的，通過將大環(huán)抗生素鍵合到膠

上制成的新式手性色譜柱。大環(huán)抗生素型手性色譜柱的出現(xiàn)歸功于Dan Armstron 的奉獻。此類色譜柱常用的大環(huán)抗生素首要由三種：利福霉素（Rifamycin），萬古霉素（Vancomycin），替考拉寧（Ticoplanin）。利福霉素作為手性增加劑在毛細管電泳分別手性化合物方面得到了成功運用。萬古霉素和替考拉寧分子結(jié)構(gòu)中存在“杯”狀結(jié)構(gòu)區(qū)和糖“平面” 結(jié)構(gòu)區(qū)。此類色譜柱性質(zhì)安穩(wěn)，可用于多種分別方式。手性分別根據(jù)氫鍵、π-π效果、構(gòu)成包合物、離子效果和肽鍵等。

替考拉寧分子量為1885，結(jié)構(gòu)中存在20個手性中心，3個糖基和4個環(huán)。酸性基團在多肽“杯”/ “裂層”的一端，堿性基團在它的另一端。酸性基團和堿性基團供應了離子效果點。糖基在三個平面上，可折疊起來將化合物分子包埋在多肽“杯”中。

萬古霉素分子量為1449，結(jié)構(gòu)中存在18個手性中心，3個環(huán)。萬古霉素具有“籃狀”結(jié)構(gòu)，它的鄰近還有一個可曲折的糖平面，可將分析物分子包埋在“籃子”中。羧基和仲氨基分布在“籃子”的邊際，參加和分析物分子產(chǎn)生離子效果。萬古霉素手性色譜柱可用于反相方式、正相方式和極性方式。萬古霉素手性色譜柱可以分別胺類、中性酰胺、脂類。但關于酸性化合物選擇性較低。在反相方式中，有機相常用四氫呋喃、乙腈和甲醇。水相常用三乙胺-乙酸緩沖液。色譜柱適用的pH規(guī)劃為4-7。一般優(yōu)化堿性化合物手性分別條件時，選擇pH=7 為起點比較好。其他四氫呋喃、乙腈有*好的選擇性。有時選用純的甲醇和乙醇作活動相也可抵達好的分別效果。萬古霉素手性色譜柱也可用正相方式，選用正己烷/乙醇為活動相。

萬古霉素手性色譜柱載樣量可以很大，十分適用于制備色譜。

6、蛋白質(zhì)型：

蛋白質(zhì)型手性色譜柱歸于第5種類型。分別依賴于疏水互相效果和極性互相效果。已經(jīng)有多種蛋白質(zhì)用于此類手性色譜柱。運用較多的是α-酸性糖蛋白（α-Acid Glycoprotein，AGP），人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA），牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和卵類粘蛋白（Ovomucoid，OV）。

α-酸性糖蛋白分子由181個氨基酸殘基和40個唾液酸（sialic acid）殘基構(gòu)成。α-酸性糖蛋白分子偏酸性，等電點為2.7。含有兩個二硫鍵，性質(zhì)很安穩(wěn)。α-酸性糖蛋白分子可以共價鍵合到硅膠上，制成手性色譜柱，可以分別許多化合物。

α-酸性糖蛋白手性色譜柱運用的活動相一般為pH 4-7的磷酸鹽緩沖液和很小比例的有機相。有機相首選異丙醇，如達不到分別要求，可以嘗試乙腈，乙醇，甲醇或四氫呋喃。有機相的改動導致蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生暫時的改動。色譜柱的負載量至關重要，典型的負載量為0.02mg/ml的濃度樣品，進樣20μl。pH 的改動對手性選擇性起關鍵效果，尤其是胺類化合物。pH下降導致蛋白質(zhì)負電荷的下降，引起胺類化合物保存時刻減小，然而這意味著可以減小有機相比例，使選擇性增加，峰形改進。

通過調(diào)理有機相比例仍無法抵達分別效果時，有時需用電荷調(diào)理劑。但這或許引起蛋白結(jié)構(gòu)的永久改動，這些電荷調(diào)理劑包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有時也用到1，2 亞乙基二醇，1，2丁醇和氯化鈉。溫度對分別也有影響，溫度增加保存時刻，減小分別因子。

人血清白蛋白（HSA）分子量為69,000，等電點為4.8。蛋白中認為存在兩個藥物結(jié)合位點：華法則-氮雜普魯帕宗（warfarin-azapropazone）和苯基二氮雜-吲哚（benzodiazapine-indole）結(jié)合位點。活動相中參加辛酸，選用人血清白蛋白手性色譜柱可以有用分別benzodiazapine。Warfarin 和oxazepam也用人血清白蛋白手性色譜柱得到了分別，活動相組成為：100mM磷酸緩沖液pH7：乙腈：異丙醇 = 84：10：6。

牛血清白蛋白（BSA）為球型蛋白，分子量為66,000，等電點為4.7。此蛋白為一個單氨基酸鏈，通過17個二硫鍵構(gòu)成9個雙環(huán)。許多化合物通過牛血清白蛋白手性色譜柱得到分別。牛血清白蛋白不如α-酸性糖蛋白安穩(wěn)，一些有機溶劑（如乙腈、甲醇）可使蛋白變性，因此運用起來要特別注意。

卵類粘蛋白由蛋清中提取，分子量為55,000。它可分別很多的胺類和酸類化合物。

蛋白手性色譜柱的載樣量均較小。影響了蛋白手性色譜柱在制備色譜中的運用。

蛋白手性色譜柱在所有手性色譜柱中是運用*廣的色譜柱，但并不是效果*好的色譜柱。

7、冠醚型：

冠醚類固定相用于分別一級胺，一級胺有必要質(zhì)子化方能抵達分別。因此有必要

運用酸性活動相，如高氯酸。*常用的是冠醚類固定相是18-冠-6，已有商品化

產(chǎn)品，由Daicel公司制作。不管（+）或（-）型均可抵達有用分別，并可通過改動（+）（-）類型而改動分析物出峰順序。冠醚作為增加劑也用于核磁共振和電泳，但由于其毒性較大，有致癌性，使其運用受到限制。